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袁　 鏗1, 汪　 泱2, 詹天佐3

(1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所腫瘤研究室, 江西 南昌 330006;
2.江西醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所 ,江西 南昌 330006;
3.廣東省珠海市香州醫(yī)院口腔科, 廣東 珠海 519000)

摘要:目的:制備具有高效免疫活性的抗致齲菌雞卵黃免疫球蛋白(IgY), 評(píng)估其臨床防齲功能。 方法:以變形鏈球菌皮下注射免疫產(chǎn)蛋母雞, 采用聚乙二醇(PEG)兩步沉淀法提取 IgY, 微量凝集試驗(yàn)檢測(cè) IgY 免疫效價(jià)及交叉免疫

特性, 并觀察其抑菌效果, 與含氟漱口水比較其臨床防齲功能。 結(jié)果:作者制備的 IgY 免疫效價(jià)為 1∶512, 具有抑制變形鏈球菌生長(zhǎng), 并與其他較常見的變形鏈球菌 c、e、f 血清型結(jié)合發(fā)生交叉凝集反應(yīng), 經(jīng)臨床驗(yàn)證結(jié)果表明 IgY 漱口水與含氟漱口水齲患發(fā)生率相近。 結(jié)論:抗變形鏈球菌雞卵黃免疫球蛋白制劑具有防齲功能。

關(guān)鍵詞:變形鏈球菌;IgY抗體;齲齒 預(yù)防和控制

中圖分類號(hào):R781.1;R378.1 + 1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-2294(2002)06-0153-03

Preparation and Clinical Effect of IgY of Anti-Cariogenic Bacterial

YUAN Keng1, WANG Yang2, ZHAN Tian-zuo3

(1.Department of Tumour , jiangxi Provincial Research Institute of Medical Sciences,

Nanchang 330006, China ;2.Department of Urology , the First Affiliated

Hospital ,Jiangxi Medical College , Nanchang 330006, China ;

3.Department of Stomatology , Xiangzhou Hospital of Zhuhai ,Zhuhai 519000 ,China)

Abstract:Objective :To Prepare IgY extracted from chicken-egg-yolk and to evaluate its anticarious effect .Methods:Egg-laying henswere immunized with hypodermal injection of streptococcus mutans.IgY was puri-

fied with PEG two-step precipitation .The titer and specific property of cross-immunization of IgYwere detectedby microagglutination tests.Its bacteriostatic effect was observed and its clinical anticariogenic function was

compared with that of fluorine-containing gargle .Results:The titer of IgY prepared in the laboratory was 1∶512 with properties of inhibiting growth of streptococcus mutans and having cross-agglutinative reaction with other common S .mutans c, e ,f serum groups.Clinical verification proved approximate incidence of dental caries in population using IgY gargle and in those using gargle containing fluorine .Conclusion:Preparation of anti-S .mu-

tans chicken-egg-yold immunoglobulin has protection against dental caries.Key words:streptococcus mutans;IgY antibody;dental caries prevention and control

       齲病是人群中普遍存在的感染性疾病, 嚴(yán)重?fù)p害醫(yī)學(xué)人體美, 尤其是容貌美 ;變形鏈球菌與齲病的關(guān)系十分密切 , 為了尋找有效的防齲手段[ 1]上世紀(jì)60年代起國(guó)外學(xué)者便開始了免疫防齲研究 。近年來,由于被動(dòng)免疫較主動(dòng)免疫安全性高 , 可行性好 ,被廣大學(xué)者所重視[ 2]。

       從雞卵中獲得的抗體 IgY 具有不同于 IgG 的生物特征,如 IgY對(duì)哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體成分無固定作用 ,也不與 FC 段結(jié)合 , 它對(duì)人類的病原體及哺乳動(dòng)物的高度保守的蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng) ,而且對(duì)熱 、酸均具有很強(qiáng)的耐受性, 穩(wěn)定性好, 制備簡(jiǎn)單,來源方便[ 3]。因此, 作者制備了抗致齲菌IgY,并對(duì)其體外免疫學(xué)功能及體內(nèi)防齲功能進(jìn)行研究。

1　 材料與方法

1.1 　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

      美國(guó)來亨雞(本院動(dòng)物科學(xué)部提供)39 只, 常規(guī)飼養(yǎng) 。

1.2 　抗原制備

      變形鏈球菌 Inbritt(c)、LM 7 (e)、OMZ-175(f)、BHR(d)菌種由北京市口腔醫(yī)學(xué)研究所提供 。用自配含蔗糖的TS 培養(yǎng)基于厭氧環(huán)境中復(fù)蘇,培養(yǎng)變形鏈球菌 48 h , 增菌培養(yǎng) 48 h, 收集變形鏈球菌, 用PBS 洗滌后調(diào)節(jié)菌濃度至 2×109 CFU ml , 超聲波粉碎,4℃保存?zhèn)溆?。

1.3 　免疫

      150 d齡健康開產(chǎn)母雞, 隔離喂養(yǎng)一周 。以 2×109 CFU ml 變形鏈球菌與等量福氏完全佐劑對(duì)母雞進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射,3 周后進(jìn)行再次免疫 ,首次免疫兩周后試血開始收集雞蛋 。從免疫前一周起每周連續(xù)觀察雞血清抗體效價(jià), 當(dāng)抗體效價(jià)趨于下降時(shí), 加強(qiáng)免疫一次。

1.4 　抗變形鏈球菌 IgY 的提取

      采用聚乙二醇二步沉淀法。取卵黃, 加入二倍量的 PBS 和 3.5%(W V)聚乙二醇 MW6 000 混勻后,離心, 9 000rpm, 15 min。取上清加入同上 PEG ,使其成12%濃度(W V),離心 9 000rpm ,15 min,將沉淀溶于 PBS 中 , 即為變形鏈球菌 IgY 粗制品 。用同樣方法提取未免疫雞卵黃 IgY 作對(duì)照 。Lowry 法測(cè)定蛋白含量。

1.5 　微量凝集試驗(yàn)檢測(cè) IgY 免疫效價(jià)

      收集培養(yǎng) 48 h 變形鏈球菌 ,用生理鹽水洗滌后計(jì)數(shù), 調(diào)細(xì)菌濃度至 5×106 ml , 加入 U 型微量板中 ,每孔 50 μl ,抗變形鏈球菌 IgY(蛋白含量調(diào)至 2 mgml)作倍比稀釋,每孔50 μl ,混勻 ,置37℃孵育 2 h后置4℃24 h 后觀察凝集果。同時(shí)設(shè)未免疫雞卵黃IgY 作對(duì)照。以能發(fā)生凝集反應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為凝集效價(jià) 。

1.6　抗變形鏈球菌 IgY 與其他血清型變形鏈球菌

     交叉凝集反應(yīng)

     將變形鏈球菌 Inbritt(c)、OMZ-175(f)、LM 7 (e)、BHR(d)分別與抗變形鏈球菌 IgY 進(jìn)行凝集試驗(yàn), 方法同上。

1.7　IgY 抑菌試驗(yàn)

     實(shí)驗(yàn)組:將5×106 ml 變形鏈球菌與抗變形鏈球菌 IgY(蛋白含量為 2 mg ml)混合 , 增菌培養(yǎng) 48 h后, 用平板傾注法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù) ,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。對(duì)照組:以PBS 代替 IgY。每樣本設(shè) 3 個(gè)復(fù)管。

1.8　臨床觀察實(shí)驗(yàn)

     將 IgY 漱口水(抗體效價(jià)為 1∶64)與 0.2%NaF漱口水進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn) ,比較兩種含漱液對(duì)齲齒發(fā)生率的影響 。隨機(jī)選 200名 4～ 6 歲兒童 ,分成 IgY 漱口水組:99 人和 NaF 漱口水組:93 人, 試前作基線調(diào)查, 統(tǒng)計(jì)齲均 。含嗽方法 :先偏左 ,后偏右, 最后居中含漱 1 min ,每周 1 次, 連續(xù) 3 個(gè)月 ,統(tǒng)計(jì)齲均 。

1.9　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

     采用 χ2檢驗(yàn) 。

2　 結(jié)果

      抗變形鏈球菌 IgY 抑菌實(shí)驗(yàn)室結(jié)果顯示, 實(shí)驗(yàn)組菌落形成單位為(5±1.4)×109 CFU ml , 對(duì)照組菌落形成單位為(1.5±0.6)×1012 CFU ml ,實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌生長(zhǎng)明顯少于對(duì)照組(P <0.01)。結(jié)果說明抗變形鏈球菌 IgY 具有抑制變形鏈球菌生長(zhǎng)的作用。

      臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示, IgY 漱口水組 99 人, 患齲68 人, 患齲率為 68.7%, 較實(shí)驗(yàn)前上升 2.4%;NaF漱口水對(duì)照組 93 人, 患齲 63 人, 患齲率為 67.7%,較實(shí)驗(yàn)前上升3.2%,經(jīng) χ2檢驗(yàn) ,兩組患齲率無顯著性差異(P >0.05), 見表 2。結(jié)果初步表明 , 含 IgY漱口水與含氟漱口水預(yù)防齲齒發(fā)生率相近, 齲齒上升率甚至低于后者。

3　 討論

      變形鏈球菌是公認(rèn)的致齲菌。采用抑制細(xì)菌的方法可以有效地預(yù)防齲病發(fā)生 。本實(shí)驗(yàn)以變形鏈球菌 Inbritt(c)、OMZ-175(f)、LM 7 (e)、BHR(d)為抗原免疫母雞 ,用聚乙二醇兩步沉淀法從雞卵黃中提取抗變形鏈球菌 IgY,蛋白含量測(cè)定每枚雞卵可制備 100mg 左右特異性抗體。這種來源充分, 成本低的方法,使得大量提取特異性抗體具有可行性 。許多研究表明,用 IgY特異性抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫,在腸道細(xì)菌感染 、病毒以及寄生蟲感染防治方面有顯著作用[ 4],近年來國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者在 IgY 免疫防齲方面也進(jìn)行了一些探討, 并取得了一定的進(jìn)展[ 1～3、5～ 7]。有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果表明 IgY 免疫組齲齒記分明顯低于對(duì)照組 。而 IgY 抗體的免疫效應(yīng)也在我們上述一系列實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí) 。

      還有研究表明 ,特異性單克隆抗體能夠有效阻止變形鏈球菌定居于牙齒表面 , 從而預(yù)防齲齒發(fā)生[ 7]。作者成功地獲得特異性抗變形鏈球菌 IgY 以后, 經(jīng)過臨床驗(yàn)證, 其防齲效果與 NaF 相當(dāng)。NaF 具有較好的防齲效果已被公認(rèn), 但過量攝入對(duì)人體有害。而 IgY 來源于雞蛋,對(duì)人體無毒副作用,且來源廣泛 ,產(chǎn)量高, 抗原應(yīng)答反應(yīng)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng), 便于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),因此有必要對(duì)其有效防齲的最佳濃度及保存方式等作進(jìn)一步探索 。

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(責(zé)任編輯:胡煒華)